Swiss albino ırkı farelerde sperma kalitesinin belirlenmesi amacıyla hos testi sonuçları ve diğer spermatolojik parametreler arasındaki ilişkinin araştırılması

Swiss albino ırkı fare spermatozoonlarında plazma membranının bütünlüğünün belirlenmesi amacıyla klasik supravital boyama yöntemi ile kombine edilmiş modifiye bir hipoozmotik şişme testi (HOS) olan HE (HOS-Eosin - Y) testinin motilite, ölü-canlı ve anormal spermatozoon oranları gibi klasik spermatolojik parametrelerle olan korelasyonu araştırıldı. Çalışmada en az 12 haftalık dişi ve erkek fareler kullanıldı. Çalışma grubuna alınmadan önce erkek fareler in vivo fertilite düzeylerinin kontrol edilmesi amacıyla iki dişi fare ile çiftleştirilerek fertil oldukları ve gebelik sağlayabildikleri doğrulandı. Çalışmanın ilk aşamasında HE testinin yapılması amacıyla uygun ozmotik basınç aralığının belirlenmesi amaçlandı. Erkek fareler servikal dislokasyonla ötenazi yapıldıktan sonra cauda epididimisleri ayrıldı ve sperma sıvı parafin ile örtülmüş Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) içerisinde toplandı. Alınan sperma 20, 40, 80, 120, 160, 200, 240, 280, 320, 360 ve 400 mOsm'lük fruktoz solüsyonu içerisinde 30 dk süreyle inkübe edilerek, inkübasyon sonrası eosin ? nigrosin boyası ile boyanıp toplam kıvrık kuyruklu ve boya almamış spermatozoon oranları belirlendi. Bu aşamada 20, 40, 80, 120 ve 160 mOsm lük solüsyonlarda elde edilen şişme cevaplarının (% 52.3 ± 4.7 - 41.5 ± 5.7) istatistiksel olarak benzer olmasına rağmen, 180 ? 400 mOsm gruptan önemli ölçüde yüksek olduğu saptandı. Bu nedenle bu aralıktaki (20 ? 160 mOsm) median grup 80 mOsm olarak belirlendi ve çalışmanın ikinci aşamasında HE testi için bu osmotik basınç eşiği kullanıldı. Çalışmanın ikinci aşamasında ise 80 mOsm'de yapılan HE testi sonrasında kuyruk kıvrılması ve başın boya alması durumu dikkate alınarak spermatozoonlar 4 ayrı tip altında sınıflandırıldı. Buna göre Tip1: Boya almamış-kıvrık kuyruklu; Tip2: Boya almış-kıvrık kuyruklu; Tip3:Boya almamış-düz kuyruklu ve Tip4: Boya almış-düz kuyruklu olarak sınıflandırıldı. Yapılan korelasyon analizi motilite değerleri ile Tip1, Tip2 ve Tip3 spermatozoon oranlarının önemli ölçüde (P<0.05) korelasyon gösterdiğini ortaya koymuştur. Akrozom, baş, orta kısım anomalileri ile HE testi sonuçları arasında korelasyon bulunamazken kuyruk anomalileri ile Tip1 spermatozoon oranı arasında önemli bir negaif korelasyon saptanmıştır (P<0.01). Ölü-canlı spermatozoon oranları ile HE testi arasında herhangi bir korelasyon tespit edilememiştir. Sonuç olarak, farelerde HOS testi için uygun ozmotik aralığın 20 - 160 mOsm olduğu belirlenmiş, bu aralıkta (80 mOsm) uygulanan HE testi sonucunda boya alan ve almayan spermatozoonlarda ayrı ayrı membran bütünlüğü belirlenebilmiş ve HE testi sonuçlarının bazı anormal spermatozoon tipleri (özellikle kuyruk) ve motilite düzeyleri ile korelasyon gösterdiği ancak ölü - canlı spermatozoon oranlarıyla korelasyon göstermediği belirlenmiştir.

The correlation between HE (HOS-Eosin-Y; a modified hypoosmotic swelling (HOS) test combined with supravital staining) test results with conventional sperm parameters i.e., motility, live-dead and abnormal sperm rate, was evaluated to estimate functional integrity of sperm plasma membranes in Swiss albino mice. Male and female mice at least 12 weeks old were used in the experiments. Fertility level of each male was confirmed by mating tests in the cage with two females. The first step of the study focussed on determination of the optimum range of osmotic pressure to provide maximum curled tail sperm rate (for HE test) which indicates swelling of the plasma membrane. Sperm was collected directly from caudal part of the epididymides from males sacrificed by cervical dislocation in Dulbecco?s phosphate buffered saline (D-PBS) covered by paraffin oil. Sperm cells were exposed to 20, 40, 80, 120, 160, 200, 240, 280, 320, 360 or 400 mOsm fructose solution for 30 minutes and the percentage of the curled tail and stained sperm cells after incubation were determined in the each group following eosin-nigrosin staining. Although curled tail sperm rate were similar in 20, 40, 80, 120 and 160 mOsm groups, varied between 52.3 ± 4.7 and 41.5 ± 5.7 %, it was significantly higher compared to the curled tail sperm rate obtained in 180 ? 400 mOsm group. Therefore, median group of 80 mOsm, between 20 ? 160 mOsm, was selected for the HE tests to be performed in the following experiments. In the second part of the study sperm cells were classified into four groups according to swelling status of the tail and eosin-Y exclusion as Type1:Unstained-curled tail; Type2: Stained-curled tail; Type3: Unstained-straight tail; Type4: Stained-straight tail. Correlation analysis between HE test results and conventional sperm parameters indicated that individual motility score is correlated significantly with Type1, 2 and 3 sperms (P<0.05) in HE test. While the percentage of the sperm cells with acrosomal, head and mid-peace were not correlated with HE test results, the sperm rate with tail abnormality was negatively correlated with Type1 sperm cells (P<0.01). No significant relationship was determined between HE test results and the live-dead sperm ratio. In conclusion, proper osmotic range for the HOS test in mouse sperm was determined as 20-160 mOsm. Functional integrity of the sperm plasma membranes could be determined separately both in live and dead sperm cells by means of 80 mOsm HE test which also correlated with certain type of sperm abnormalities (especially tail) and motility score but not with the live-dead sperm rate.